Is-sekwenzar tad-DNA jiddependi wkoll fuq il-kapaċità tagħna li tuża l- elettroforeżi tal-ġell biex tissepara l-linji tad-DNA li jvarjaw fid-daqs minn par wieħed biss.
Sekwenzjar tad-DNA
Fl-aħħar tas-sebgħin, ġew ivvintati żewġ tekniki ta 'sekwenzar tad-DNA għal molekuli tad-DNA itwal. Dawn kienu l-metodu Sanger (jew dideożju) u l-metodu Maxam-Gilbert (qsim kimiku). Il-metodu Maxam-Gilbert huwa bbażat fuq qsim speċifiku min-nukleotide mill-kimiċi u huwa l-aħjar użat biex jissekwestra oligonucleotides (polimeri nukleotidi qosra, ġeneralment iżgħar minn 50 pari bażi fit-tul). Il-metodu Sanger huwa użat aktar komunement minħabba li ġie ppruvat teknikament iktar faċli biex jiġi applikat, u, bil- miġja ta 'PCR u awtomazzjoni tat-teknika, huwa applikat faċilment għal linji twal ta' DNA inkluż xi ġeni sħaħ. Din it-teknika hija bbażata fuq it-terminazzjoni tal-katina minn dideoxynucleotides waqt reazzjonijiet ta 'titwil ta' PCR.
Metodu Sanger
Fil-metodu Sanger, il-linja tad-DNA li għandha tiġi analizzata tintuża bħala template u d-DNA polymerase jintuża, f'reazzjoni ta 'PCR, biex jiġġenera linji kumplimentari bl-użu ta' primers.
Erba 'taħlitiet ta' reazzjoni PCR differenti huma ppreparati, kull wieħed minnhom fih ċertu perċentwal ta 'analogi ta' dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) għal wieħed mill-erba 'nucleotides (ATP, CTP, GTP jew TTP). Is-sintesi tal-linja tad-DNA l-ġdida tkompli sakemm wieħed minn dawn l-Analogi jiġi inkorporat, f'liema ħin il-linja tkun maqtugħa qabel iż-żmien.
Kull reazzjoni tal-PCR se tispiċċa u fiha taħlita ta 'tulijiet differenti ta' linji tad-DNA, li kollha jispiċċaw bin-nukleotide li kien id-dijossidu ttikkettat għal dik ir-reazzjoni. L- elettroforeżi tal-ġell hija mbagħad użata biex tissepara l-linji tal-erba 'reazzjonijiet, f'erba' korsiji separati, u tiddetermina s-sekwenza tal-mudell oriġinali bbażat fuq liema tulijiet ta 'fergħat jispiċċaw b'liema nucleotide.
Fir-reazzjoni awtomatizzata ta 'Sanger, jintużaw il-primers li huma ttikkettati b'erba' tikketti fluworexxenti kkuluriti differenti. Ir-reazzjonijiet tal-PCR, fil-preżenza tan-nukleotidi differenti tad-dojojdi, huma mwettqa kif deskritt hawn fuq. Imma, wara, l-erba 'taħlitiet ta' reazzjoni mbagħad jiġu kkombinati u applikati għal linja waħda ta 'ġell. Il-kulur ta 'kull framment jinstab permezz ta' raġġ tal-lejżer u l-informazzjoni tinġabar minn kompjuter li jiġġenera kromatogrammi li juru l-qċaċet għal kull kulur, li minnhom is-sekwenza tad-DNA tal-mudell tista 'tiġi determinata.
Tipikament, il-metodu awtomatizzat ta 'sekwenzar huwa preċiż biss għal sekwenzi sa massimu ta' madwar 700-800 bażi-pari fit-tul. Madankollu, huwa possibbli li jinkisbu sekwenzi sħaħ ta 'ġeni akbar u, fil-fatt, ġenomi sħaħ, bl-użu ta' metodi pass-għaqli bħal Primer Walking u sekwenzar Shotgun.
Fil Primer Walking , porzjon operabbli ta 'ġene akbar huwa ssekwenzjat bl-użu tal-metodu Sanger. Primers ġodda huma ġġenerati minn segment affidabbli tas-sekwenza u jintużaw biex ikomplu jissekċinaw il-porzjon tal-ġene li kien barra mill-firxa tar-reazzjonijiet oriġinali.
Is-sekwenzar tal-isparkun jinvolvi li jinqatgħu bl-addoċċ is-segment tad-DNA ta 'interess għal frammenti aktar xierqa (maniġġabbli), li jissekwestraw kull framment, u jirranġaw il-biċċiet ibbażati fuq sekwenzi li jikkoinċidu. Din it-teknika ġiet iffaċilitata bl-applikazzjoni ta 'softwer tal-kompjuter għall-arranġament tal-biċċiet li jikkoinċidu.