Liema PCR għandha tagħmel bis-Sekwenzar tad-DNA u l-Amplifikazzjoni tal-Ġeni
Ir-reazzjoni katina tal-polimerasa ( PCR ) hija teknika ġenetika molekulari biex tagħmel kopji multipli ta 'ġene u hija wkoll parti mill-proċess ta' sekwenzar tal-ġeni.
Kif Taħdem il-Katina tal-Polymerase?
Il-kopji tal-ġeni jsiru bl-użu ta 'kampjun tad-DNA, u t-teknoloġija hija tajba biżżejjed biex tagħmel kopji multipli minn kopja waħda tal-ġene misjub fil-kampjun. L-amplifikazzjoni tal-PCR ta 'ġene li tagħmel miljuni ta' kopji tippermetti l-individwazzjoni u l-identifikazzjoni ta 'sekwenzi tal-ġeni bl-użu ta' tekniki viżivi bbażati fuq daqs u charge (+ jew -) tal-biċċa tad-DNA.
Taħt kondizzjonijiet ikkontrollati, segmenti żgħar tad-DNA huma ġenerati minn enzimi magħrufa bħala DNA polymerases, li jżidu deoxynucleotides kumplimentari (dNTPs) ma 'biċċa ta' DNA magħrufa bħala "template". Anki biċċiet iżgħar ta 'DNA, imsejħa "primers" jintużaw bħala punt tat-tluq għall-polimerażi. Primers huma biċċiet żgħar ta 'DNA magħmulin mill-bniedem (oligomers), normalment bejn 15 u 30 nuklejotidi twal. Jagħmluhom billi jafu jew jiddubitaw sekwenzi qosra tad-DNA fit-trufijiet tal-ġene li qed jiġu amplifikati. Matul il-PCR, id-DNA li ġie ssekwenzat huwa msaħħan u t-taqsimiet doppji separati. Mat-tkessiħ, il-primers jorbtu mal-mudell (imsejjaħ ittemprar) u joħolqu post għall-polimerażi biex tibda.
It-Teknika tal-PCR
Ir-reazzjoni katina tal-polymerase (PCR) kienet possibbli bl-iskoperta ta 'thermophiles u enżimi termofiliċi polimerasi (enzimi li jżommu l-integrità u l-funzjonalità strutturali wara li jsaħħnu f'temperaturi għoljin).
Il-passi involuti fit-teknika tal-PCR huma kif ġej:
- Taħlita hija maħluqa, b'konċentrazzjonijiet ottimizzati tal-mudell tad-DNA, l-enzima polimerase, l-primers u dNTPs. Il-kapaċità tas-sħana tat-taħlita mingħajr l-iżnaturazzjoni ta 'l-enżima tippermetti l-iżnaturazzjoni tal-ħxuna doppja tal-kampjun tad-DNA f'temperaturi ta' 94 grad Celsius.
- Wara d-denaturazzjoni, il-kampjun jitkessaħ għal medda aktar moderata, madwar 54 grad, li jiffaċilita l-ittemprar (li jgħaqqad) tal-primers mal-mudell tad-DNA ta 'stranded singolu.
- Fit-tielet stadju taċ-ċiklu, il-kampjun jerġa 'jiġi msaħħan għal 72 grad, it-temperatura ideali għal Taq DNA Polymerase, għat-titwil. Matul it-titwil, id-DNA polymerase juża l-linja singola oriġinali tad-DNA bħala template biex iżid dNTPs komplementari mat-truf ta '3 "ta' kull primer u jiġġenera sezzjoni ta 'DNA double strand fir-reġjun tal-ġene ta' interess.
- Primers li ttellgħu għal sekwenzi tad-DNA li mhumiex konkordanza eżatta ma jibqgħux ittemprati fi 72 grad, u b'hekk jillimitaw it-titwil tal-ġene ta 'interess.
Dan il-proċess ta 'denaturizzazzjoni, ittemprar u elongazzjoni huma ripetuti multipli (30-40) darbiet, u b'hekk jiżdied b'mod esponenzjali n-numru ta' kopji tal-ġenu mixtieq fit-taħlita. Għalkemm dan il-proċess ikun pjuttost tedjanti jekk isir manwalment, il-kampjuni jistgħu jitħejjew u jiġu inkubati f'Termocycler programmabbli, li issa huwa komuni fil-biċċa l-kbira tal-laboratorji molekulari, u reazzjoni kompluta tal-PCR tista 'ssir fi 3-4 sigħat.
Kull stadju ta 'denatura jwaqqaf il-proċess tat-titwil taċ-ċiklu ta' qabel, u b'hekk jaqta 'l-linja l-ġdida tad-DNA u jżommha madwar id-daqs tal-ġeni mixtieq.
It-tul taċ-ċiklu tat-titwil jista 'jsir itwal jew iqsar skond id-daqs tal-ġene ta' interess, iżda eventwalment, permezz ta 'ċikli ripetuti ta' PCR, il-maġġoranza tal-mudelli se jkunu ristretti għad-daqs tal-ġene ta 'interess biss ikunu ġew iġġenerati minn prodotti taż-żewġ primers.
Hemm diversi fatturi differenti għal PCR ta 'suċċess li jistgħu jiġu manipulati biex itejbu r-riżultati. Il-metodu l-aktar wżat biex jittestja l-preżenza tal-prodott tal-PCR huwa l- elettroforeżi bil-ġell ta 'l-agarose . Li jintuża biex jissepara l-frammenti tad-DNA ibbażati fuq id-daqs u l-ħlas. Il-frammenti huma mbagħad viżwalizzati bl-użu ta 'kuluri jew radjuisotopi.
L-Evoluzzjoni
Minn mindu saret l-iskoperta tal-PCR, instabu polimerasi tad-DNA barra mill-Taq oriġinali. Xi wħud minnhom għandhom kapaċità ta '"proofreading" aħjar jew huma aktar stabbli f'temperaturi ogħla, u b'hekk itejbu l-ispeċifiċità tal-PCR u jnaqqsu l-iżbalji mill-inserzjoni tad-dNTP inkorretta.
Xi varjazzjonijiet ta 'PCR ġew iddisinjati għal applikazzjonijiet speċifiċi u issa huma użati regolarment f'laboratorji ġenetiċi molekulari. Xi wħud minn dawn huma PCR fi Real-Time PCR u Reverse-Transcriptase. L-iskoperta ta 'PCR wasslet ukoll għall-iżvilupp ta' sekwenzar tad-DNA, marki tas-swaba tad-DNA u tekniki molekulari oħra.