Aġġustamenti għal xi wieħed mill-komponenti ta 'Reazzjoni tal-Katina tal-Polimerija (PCR) jistgħu jbiddlu l-kwalità tar-riżultat, jew billi jtejbu jew inaqqsu r-rendiment u l-kwalità tal-prodott jew billi jtejbu l-ispeċifiċità u s-sensittività tar-reazzjoni. Il-parametri li jinfluwenzaw ir-riżultat aħħari jistgħu jkunu fiżiċi (jiġifieri, temperatura, ħinijiet taċ-ċiklu) jew kimiċi (jiġifieri, konċentrazzjoni template, tip ta 'enzima użata). Dawn li ġejjin huma diversi fatturi ewlenin li jinfluwenzaw is-suċċess tal-PCR.
01 Kondizzjonijiet tal-Laboratorju Nadif
Peress li l- PCR huwa kapaċi jidentifika molekula waħda tad-DNA, huwa importanti li jinżammu kundizzjonijiet verġni fil-laboratorju. Dejjem għandek ingwanti friski, uża oġġetti tal-ħġieġ sterili, tubi u ponot tal-pipetta u soluzzjonijiet sterili, u tnaddaf iż-żona tax-xogħol qabel tibda taħdem.
Dejjem tinkludi reazzjonijiet ta 'kontroll, mingħajr DNA template u mingħajr enżima, biex tiżgura li r-riżultati huma tassew minħabba l-amplifikazzjoni tal-kampjun it-tajjeb.
Il-biċċa l-kbira tan-nies jaraw li jkollhom sett ta 'soluzzjonijiet tagħhom stess li mhumiex maqsuma biex is-soluzzjoni tal-problemi tkun aktar faċli u l-pipetti nnominati huma spiss imwarrba għal PCR biss. Tubi PCR mingħajr DNase u RNase, ponot tal-pipetta reżistenti għall-ajrusol u jaħdmu f'food hood b'dawl UV huma wkoll modi biex jimminimizzaw il-problemi.
02 Komponenti Kimiċi
- Ikunu 18 sa 24 bażi
- M'għandhom l-ebda struttura sekondarja (jiġifieri, ċineg tal-hairpin)
- Trid distribuzzjoni bilanċjata ta 'pari ta' G / C u A / T
- Mhumiex kumplimentari ma 'xulxin fit-truf ta' 3 mili
- Għandhom temperaturi tat-tidwib (Tm) madwar 5-10 gradi Celcius taħt it-temperatura ta 'l-ittemprar, li normalment tkun bejn 55 u 65 grad Celcius
It-Tm għaż-żewġ primers għandu jkun simili wkoll għall-aħjar riżultati.
03 Taħlita ta 'Reazzjoni: Mudell u Primers
Il-konċentrazzjonijiet prime primer huma bejn 0.1 u 0.6 micromoles / L. L-ammont ta 'mudell ivarja skond it-tip ta' DNA (bniedem, batterju, plasmid).
B'ammonti baxxi ħafna ta 'template, hemm strateġiji oħra biex itejbu r-riżultati, bħal numri taċ-ċikli miżjuda jew l-użu ta' "bidu sħun". Dejjem ittestja primers ġodda b'reazzjoni ta 'kontroll pożittiv, biex tkun żgur li jaħdmu taħt il-kondizzjonijiet sperimentali speċifiċi tiegħek.
04 Taħlita ta 'Reazzjoni: Attività ta' Enżimi
Il-konċentrazzjoni ta 'MgCl2 fit-taħlita ta' reazzjoni tista 'tinfluwenza r-riżultat tal-PCR u jista' jkollha rwol importanti f'reazzjonijiet aktar fastidjużi. Il-katio tal-manjesju jifforma kumplessi li jinħallu ma 'dNTPs biex jipproduċu s-sottostrat attwali li l-enzima polimerase tirrikonoxxi.
L-ammonti ugwali ta 'l-erba' dNTPs jgħinu wkoll biex inaqqsu r-rata ta 'żball tal-polimerażi. Ċerti addittivi bħal betaine, BSA, deterġenti, DMSO, gliċerol u pirofosfatase jistgħu wkoll jaffettwaw l-ispeċifiċità ta 'l-enżima jew l-effiċjenza tar-reazzjoni.
05 Tip ta 'Thermocycler
Meta tixtri għal tagħmir tal-laboratorju, iżomm f'moħħu li xi thermocyclers huma inqas preċiżi minn oħrajn biex jinżammu temperaturi eżatti u mixtieqa.
Dan huwa qasam fejn irħas ma tħallasx fit-tul meta tkun iffaċċjat b'reazzjoni finicky jew bl-użu ta 'primers li jeħtieġu medda dejqa ta' temperatura ta 'l-ittemprar.
Tubi ta 'reazzjoni ta' ħajt irqiq iddisinjati biex jaqblu mal-marka preċiża ta 'thermocycler li qed tuża, jgħin ukoll biex itejjeb it-temperaturi tar-reazzjoni.
06 Settings taċ-Ċiklu
Rendiment akbar jista 'jinkiseb billi jiżdied il-ħin ta' estensjoni ta 'madwar 20 ċiklu, biex tikkumpensa għal inqas enzimi biex tkabbar aktar mudelli. Normalment, inqas minn 40 ċiklu huma biżżejjed biex jamplifikaw inqas minn 10 molekuli template għal konċentrazzjoni kbira biżżejjed biex tara fuq ġel tal-agarose imtebba bromur tal- etidju .