Il-klonazzjoni tal-ġeni hija l-att li tagħmel kopji, jew kloni, ta 'ġene wieħed. Ladarba jiġi identifikat ġene, il-kloni jistgħu jintużaw f'ħafna oqsma tar-riċerka bijomedika u industrijali. L-inġinerija ġenetika hija l-proċess ta 'klonazzjoni ta' ġeni f'organiżmi ġodda jew li tbiddel is-sekwenza tad-DNA biex tibdel il-prodott tal-proteina. L-inġinerija ġenetika tiddependi mill-kapaċità tagħna li nwettqu l-proċeduri essenzjali li ġejjin.
01 Reazzjoni tal-Katina tal-Polimerija
02 Enżimi ta 'Restrizzjoni
L-iskoperta ta ' enżimi magħrufa bħala endonucleases ta' restrizzjoni kienet essenzjali għall -inġinerija tal-proteini . Dawn l-enzimi qatgħu d-DNA f'postijiet speċifiċi bbażati fuq is-sekwenza tan-nukleotide. Mijiet ta ' enzimi ta' restrizzjoni differenti, li kapaċi jnaqqsu d-DNA f'sit distint, ġew iżolati minn ħafna razez differenti ta 'batterji. Id-DNA maqtugħ b'enżimi ta 'restrizzjoni jipproduċi ħafna frak iżgħar, ta' daqsijiet differenti. Dawn jistgħu jiġu sseparati bl-użu ta 'elettroforeżi ġelatina jew kromatografija.
03 Electrophoresis
Id-DNA li tippurifika minn kultura taċ-ċelluli, jew li tnaqqasha billi tuża enzimi ta 'restrizzjoni ma tkunx ta' ħafna użu jekk ma nkunux nistgħu nħarsu d-DNA - jiġifieri, issib mod biex tara jekk l-estratt tiegħek fihx xi ħaġa, jew liema daqs frammenti int qattilna. Mod wieħed biex isir dan huwa bl-elettroforeżi tal-ġell. Il-ġellijiet huma użati għal varjetà ta 'skopijiet, milli jaraw DNA imqatta' biex jinstabu inserzjonijiet u knockouts tad-DNA.
04 Ingħaqad żewġ biċċiet tad-DNA
Fir-riċerka ġenetika, ħafna drabi huwa meħtieġ li jingħaqdu tnejn jew aktar linji individwali tad-DNA, biex tinħoloq linja rikombinanti, jew qrib ċirku ċirkulari li tnaqqas b'enżimi ta 'restrizzjoni. Enzimi msejħa DNA ligases jistgħu joħolqu rabtiet kovalenti bejn il-ktajjen tan-nukleotidi. L-enzimi DNA polymerase I u polynucleotide kinase huma wkoll importanti f'dan il-proċess, biex jimtlew vojt jew fosforilazzjoni tat-truf ta '5' rispettivament.
05 Għażla ta 'DNA Żgħir li Jirrepeti
Biċċiet ċirkulari żgħar ta 'DNA li mhumiex parti minn ġenoma tal-batterja, iżda huma kapaċi ta' awto-replikazzjoni, huma magħrufa bħala plasmidi. Il-plażmidi ħafna drabi jintużaw bħala vectors għat-trasport ta 'ġeni bejn mikro-organiżmi. Fil-bijoteknoloġija, ladarba l-ġene ta 'interess ikun ġie amplifikat u kemm il-ġene kif ukoll il-plasmid jinqatgħu mill-enzimi ta' restrizzjoni, huma marbuta flimkien biex jiġġeneraw dak magħruf bħala DNA rikombinanti. Id-DNA virali (batterjobjastiku) jista 'jintuża wkoll bħala vettur, kif jista' cosmids, plasmidi rikombinanti li jkun fihom ġeni tal-batterji.
06 Metodu biex Nimxu il-Votazzjoni f'Ċell Host
Il-proċess ta 'trasferiment ta' materjal ġenetiku fuq vettur bħal plasmid, f'ċelluli ospitanti ġodda, jissejjaħ trasformazzjoni. Din it-teknika teħtieġ li ċ-ċelloli ospitanti huma esposti għal bidla ambjentali li tagħmilhom "kompetenti" jew temporanjament permeabbli għall-vettur. L-elettroporazzjoni hija waħda minn dawn it-tekniki. Aktar ma jkun kbir il-plasmid, iktar ma tkun baxxa l-effiċjenza li biha jittieħed iċ-ċelloli. Segmenti tad-DNA akbar huma kklownjati b'mod aktar faċli bl-użu ta 'batterjuġif, retrovirus jew vectors virali oħra jew cosmids f'metodu msejjaħ transduction. Il-vectors tal-fage jew virali ħafna drabi jintużaw fil -mediċina riġenerattiva iżda jistgħu jikkawżaw inserzjoni tad-DNA f'partijiet tal-kromosomi tagħna fejn ma rriduhiex, u jikkawżaw kumplikazzjonijiet u saħansitra l-kanċer.
07 Metodi biex jintgħażlu Organiżmi Transġeniċi
Mhux iċ-ċelloli kollha jieħdu DNA matul it-trasformazzjoni. Huwa essenzjali li jkun hemm metodu biex jinstabu dawk li jagħmlu. Ġeneralment, il-plażmidi li jġorru l-ġeni għar-reżistenza għall-antibijotiċi u ċ-ċelloli transġeniċi jistgħu jintgħażlu skont l-espressjoni ta 'dawk il-ġeni u l-kapaċità tagħhom li jikbru fuq midja li fiha dak l-antibijotiku. Metodi ta 'għażla alternattivi jiddependu fuq il-preżenza ta' proteini reporter oħra bħas-sistema x-gal / lacZ , jew proteina ta 'fluworexxenza ħadra, li jippermettu l-għażla bbażata fuq il-kulur u l-fluworexxenza rispettivament.