Il-grad ta 'purità tal-proteina meħtieġ jiddependi fuq l-użu aħħari maħsub tal-proteina.
Għal xi applikazzjonijiet, estratt mhux raffinat huwa biżżejjed. Madankollu, għal użi oħra, bħal fl-ikel u l-farmaċewtiċi, huwa meħtieġ livell għoli ta 'purità. Biex tikseb dan, ħafna metodi ta 'purifikazzjoni ta' proteini jintużaw tipikament, f'serje ta 'stadji ta' purifikazzjoni.
Kull stadju ta 'purifikazzjoni tal-proteina normalment jirriżulta f'xi grad ta' telf ta 'prodott. Għalhekk, strateġija ideali ta 'purifikazzjoni tal-proteina hija waħda li fiha jintlaħaq l-ogħla livell ta' purifikazzjoni fl-inqas passi. L-għażla ta 'liema passi għall-użu hija dipendenti fuq id-daqs, il-piż, is-solubilità u proprjetajiet oħra tal-proteina fil-mira. It-tekniki li ġejjin huma l-aktar xierqa għall-purifikazzjoni ta 'proteina ċitosolika waħda. Il-purifikazzjoni tal-kumplessi ta 'proteini ċitosoliċi hija aktar ikkumplikata u normalment teħtieġ li jiġu applikati metodi differenti.
L-Ewwel Passi għall-Purifikazzjoni tal-Proteina
L-ewwel pass fil-purifikazzjoni ta ' proteini intraċellulari (ġewwa ċ-ċellula) huwa l-preparazzjoni ta' estratt mhux raffinat .
L-estratt ikun fih taħlita kumplessa tal-proteini kollha miċ-ċitoplasma taċ-ċellula, u xi makromollikuli addizzjonali, cofactors u nutrijenti. L-estratt mhux raffinat jista 'jintuża għal xi applikazzjonijiet fil-bijoteknoloġija, madankollu, jekk il-purità hija kwistjoni, għandhom jiġu segwiti passi ta' purifikazzjoni sussegwenti.
L-estratti ta 'proteina mhux raffinata huma ppreparati bit-tneħħija ta' debris ċellulari ġenerat minn lisi taċ-ċellula, li jinkiseb bl-użu ta 'kimiċi u enzimi , ivvibrar jew Stampa Franċiża. Id-debris jitneħħa permezz ta 'ċentrifugazzjoni, u s-supernatant jiġi rkuprat. Preparazzjonijiet mhux raffinati ta 'proteini extraċellulari jistgħu jinkisbu billi sempliċiment titneħħa ċ-ċelloli permezz ta' ċentrifugazzjoni.
Għal ċerti applikazzjonijiet tal- bijoteknoloġija , hemm domanda għal enżimi termostabbli : Enżimi li jistgħu jittolleraw temperaturi għoljin mingħajr denaturizzazzjoni, u filwaqt li jżommu attività speċifika għolja. L-organiżmi li jipproduċuhom xi kultant jissejħu estremophiles. Approċċ faċli għall-purifikazzjoni ta 'proteina reżistenti għas-sħana huwa li jnaddaf il-proteini l-oħra fit-taħlita billi jissaħħan, imbagħad tkessaħ is-soluzzjoni (b'hekk tippermetti li l-enżima termoestabbli tirriforma jew tħawwel mill-ġdid jekk meħtieġ.
Passi ta 'Purifikazzjoni Intermedja
Fl-imgħoddi, it-tieni stadju komuni għall-purifikazzjoni ta 'proteina minn estratt mhux raffinat kien bil- preċipitazzjoni f'soluzzjoni b'qawwa osmotika għolja (jiġifieri soluzzjonijiet tal-melħ). L-aċidi nukleiċi fl-estratt mhux maħdum jistgħu jitneħħew billi jiġu preċipitati l-aggregati ffurmati bis-sulfat ta 'streptomycin jew protamine sulfate.
Normalment il-preċipitazzjoni tal-proteini tintuża bl-ammonju sulfat bħala l-melħ.
Proteini differenti se jippreċipitaw f'konċentrazzjonijiet differenti ta 'sulfat ta' l- ammonju . B'mod ġenerali, proteini ta 'piż molekulari ogħla jippreċipitaw f'konċentrazzjonijiet iktar baxxi ta' sulfat ta 'l-ammonju. Preċipitazzjoni tal-melħ normalment ma twassalx għal proteina ppurifikata ħafna iżda tista 'tgħin fl-eliminazzjoni ta' xi proteini mhux mixtieqa f'taħlita u f'konċentrazzjoni tal-kampjun. L-imluħa fis-soluzzjoni mbagħad jitneħħew bid-dijalisi permezz ta 'tubu taċ-ċelluloża poruża, filtrazzjoni, jew kromatografija ta' esklużjoni tal-ġell.
Il-protokolli moderni tal-bijoteknoloġija spiss jieħdu vantaġġ mill-ħafna kits disponibbli kummerċjalment li jipprovdu soluzzjonijiet lesti għal proċeduri standard. Il-purifikazzjoni tal-proteina ta 'spiss titwettaq bl-użu ta' filtri u kolonni ta 'filtrazzjoni tal-ġell ippreparati Kull ma trid tagħmel hu li ssegwi l-istruzzjonijiet u żżid il-volum it-tajjeb tas-soluzzjoni t-tajba u stenna t-tul ta 'żmien speċifikat waqt li tiġbor l-eluwant (dak li joħroġ mill-aħħar tal-kolonna) f'tubu tat-test ġdid.
- Metodi kromatografiċi jistgħu jiġu applikati bl-użu ta 'kolonni fuq il-bank jew tagħmir awtomatizzat HPLC. Is-separazzjoni permezz tal-HPLC tista 'ssir permezz ta' metodi ta 'fażi inversa, skambju ta' joni jew ta 'esklużjoni tad-daqs, u kampjuni misjuba minn firxa tad-dijodi jew teknoloġija tal-lejżer. El
Viżwalizzazzjoni u Valutazzjoni tal-Proteina tal-Purifikazzjoni
- Il-kromatografija ta 'fażi reattiva (RPC) tissepara l-proteini bbażati fuq l- idrofobiċitajiet relattivi tagħhom. Din it-teknika hija selettiva ħafna iżda teħtieġ l-użu ta 'solventi organiċi. Xi proteini huma żnaturati b'mod permanenti minn solventi u jitilfu l-funzjonalità matul l-RPC. Għalhekk dan il-metodu mhux irrakkomandat għall-applikazzjonijiet kollha, b'mod partikolari jekk ikun meħtieġ li l-proteina mmirata żżomm l-attività.
- Il-kromatografija tal-iskambju joniku tirreferi għas-separazzjoni tal-proteini bbażata fuq il- ħlas . Il-kolonni jistgħu jew ikunu ppreparati għall-iskambju ta 'l-anjoni jew l-iskambju tal-katjoni. Il- kolonni tal- iskambju anjoniku fihom fażi stazzjonarja b'karika pożittiva li tattira proteini mkeċċija negattivament. Il- kolonni tal- kambju tal-katjoni huma ż-żibeġ b'lura, negattivament iċċarġjati li jattiraw proteini miżmuma pożittivament. L-elużjoni tal-proteina (jiet) immirata ssir billi jinbidel il-pH fil-kolonna, li tirriżulta f'bidla jew newtralizzazzjoni tal-gruppi funzjonali mitluba ta 'kull proteina.
- Kromatografija ta 'esklużjoni tad-daqs ( filtrazzjoni tal-ġel ) tissepara proteini akbar minn dawk żgħar peress li l-molekoli akbar jivvjaġġaw b'mod aktar mgħaġġel permezz tal-polimeru inkroċjat fil-kolonna tal-kromatografija. Il-proteini kbar ma jidħlux fil-pori tal-polimeru billi proteini iżgħar jagħmlu u jieħdu aktar żmien biex jivjaġġaw mill-kolonna tal-kromatografija, permezz tar-rotta anqas diretta tagħhom. Eluate jinġabar f'serje ta 'tubi li jisseparaw il-proteini bbażati fuq il-ħin ta' l-elużjoni. Il-filtrazzjoni tal-ġell hija għodda utli biex tikkonċentra kampjun ta 'proteina peress li l-proteina mmirata tinġabar f'volum ta' elużjoni iżgħar minn dak inizjalment miżjud mal-kolonna. Jistgħu jintużaw tekniki ta 'filtrazzjoni simili waqt il-produzzjoni ta' proteini fuq skala kbira minħabba l-kost-effettività tagħhom.
- Il-kromatografija tal-affinità hija teknika utli ħafna għal "illustrar" jew il-proċess tal-purifikazzjoni tal-proteina. Iż-żibeġ fil-kolonna tal-kromatografija huma marbuta ma 'ligand li jorbtu speċifikament mal-proteina fil-mira. Il-proteina mbagħad titneħħa mill-kolonna bit-tlaħliħ b'soluzzjoni li jkun fiha ligandi ħielsa. Dan il-metodu jagħti r-riżultati l-aktar puri u l-ogħla attività speċifika meta mqabbla ma 'tekniki oħra.
- SDS-PAGE hija l-elettroforeżi tal-polijakrilamide ġell, imwettqa fil-preżenza ta 'SDS (sodium dodecyl sulfate) li jingħaqad ma' proteini li tagħtihom charge negattiv nett kbir. Peress li l-piżijiet tal-proteini kollha huma pjuttost ugwali, dan il-metodu jifredhom kważi kompletament ibbażat fuq id-daqs. SDS-PAGE ta 'spiss jintuża biex tittestja l-purità tal-proteina wara kull pass f'serje. Billi l-proteini mhux mixtieqa jitneħħew gradwalment mit-taħlita, in-numru ta 'meded viżwalizzati fuq il-ġel SDS-PAGE huwa mnaqqas, sakemm hemm biss medda waħda li tirrappreżenta l-proteina mixtieqa.
- Immunoblotting huwa teknika ta 'viżwalizzazzjoni tal-proteina applikata flimkien ma' kromatografija ta 'affinità. L-antikorpi għal proteina speċifika huma wżati bħala ligand fuq kolonna ta 'kromatografija ta' affinità. Il-proteina mmirata tinżamm fuq il-kolonna, imbagħad titneħħa billi tlaħlaħ il-kolonna b'soluzzjoni tal-melħ jew aġenti oħra. L-antikorpi marbuta mat-tikketti tar-radjuattivi jew taż-żebgħa jgħinu fl-iskoperta tal-proteina fil-mira ladarba tkun separata mill-bqija tat-taħlita.
Sorsi:
Zubay G. 1988. Bijokimika, it-2 edizzjoni. Macmillan Publishing Co, New York, NY, USA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Manwal tal-Purifikazzjoni tal-Proteina, Edizzjoni AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc New Jersey, USA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.